導(dǎo)讀：

近年來(lái)，光學(xué)顯微鏡的技術(shù)發(fā)展日新月異。其中，熒光顯微鏡技術(shù)的迅猛發(fā)展更是極大地改變了生命科學(xué)的研究方式，已經(jīng)成為目前生命科學(xué)研究者對(duì)細(xì)胞、組織進(jìn)行成像的方法。

然而，熒光顯微鏡技術(shù)均需要對(duì)成像目標(biāo)進(jìn)行熒光分子探針標(biāo)記。這類熒光分子探針常易受光、氧、溫度、pH等因素的影響，從而失去活性，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)不準(zhǔn)確；并且有些熒光探針對(duì)不同的目標(biāo)分子具有一定的親和性，這導(dǎo)致無(wú)法對(duì)目標(biāo)分子進(jìn)行準(zhǔn)確的測(cè)量，特異性不高。此外，由于熒光顯微鏡的波段限制，一次實(shí)驗(yàn)通常不能使用超過(guò)6種顏色的熒光標(biāo)記分子。這些技術(shù)條件限制了熒光顯微鏡技術(shù)在生物科學(xué)領(lǐng)域的進(jìn)一步拓展應(yīng)用，尤其在代謝組學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、藥物學(xué)等需要對(duì)多種類目的蛋白或化合物進(jìn)行成像的研究領(lǐng)域，科研工作者亟需一種能夠兼具熒光成像和化學(xué)成像功能的新型顯微鏡技術(shù)。

新一代化學(xué)成像顯微鏡

美國(guó)PSC公司研發(fā)的新一代高分辨化學(xué)成像顯微鏡——mIRage，極大地拓展了光學(xué)顯微鏡的應(yīng)用。mIRage不僅具備傳統(tǒng)熒光顯微鏡的熒光成像功能，還采用新型光學(xué)光熱紅外（O-PTIR）技術(shù)，能夠?qū)ξ镔|(zhì)的分子結(jié)構(gòu)進(jìn)行無(wú)熒光標(biāo)記的化學(xué)成像，解決了傳統(tǒng)化學(xué)成像空間分辨率低的問(wèn)題，其化學(xué)成像分辨高達(dá)500 nm，可在亞微米尺度上對(duì)細(xì)胞或組織內(nèi)的目的蛋白或分子進(jìn)行表征。這為代謝組學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、藥物學(xué)等多個(gè)生命科學(xué)研究領(lǐng)域提供了新的手段，是對(duì)傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡的全新拓展和補(bǔ)充。

mIRage部分應(yīng)用領(lǐng)域

新一代高分辨化學(xué)成像顯微鏡——mIRage

mIRage的優(yōu)勢(shì)：

• 亞微米空間分辨的紅外光譜和拉曼高光譜成像（~500 nm）；

• 與透射模式相媲美的反射模式下的圖譜效果；

• 非接觸測(cè)量模式—使用簡(jiǎn)單快捷，無(wú)交叉污染風(fēng)險(xiǎn)；

• 很少或無(wú)需樣品制備過(guò)程(無(wú)需薄片), 可測(cè)試厚樣品；

• 可透射模式下觀察溶液中的樣品；

• 實(shí)現(xiàn)同時(shí)同地相同分辨率的IR和Raman測(cè)試；

• 熒光顯微成像實(shí)現(xiàn)熒光標(biāo)記樣品快速定位。

一、mIRage助力單細(xì)胞脂質(zhì)代謝成像分析

加州大學(xué)圣巴巴拉分校的Kenneth S. Kosik研究組以棕櫚酸疊氮化物（azide-PA）作為探針，使用mIRage檢測(cè)體外細(xì)胞模型中新合成的脂質(zhì)以研究細(xì)胞脂代謝。該成果以Single-cell mapping of lipid metabolites using an infrared probe in human-derived model systems為題發(fā)表在Nature communication（影響因子16.6 ） 上。

在本研究中，該團(tuán)隊(duì)構(gòu)建了一個(gè)單細(xì)胞代謝成像平臺(tái)，能夠在各種人類衍生的 2D 和 3D 培養(yǎng)系統(tǒng)中以高特異性直接成像脂質(zhì)代謝。通過(guò)加入疊氮化物標(biāo)記的紅外探針（azide-PA），可用作核苷酸的修飾標(biāo)記，脂肪酸代謝的分子探針；azide-PA加入培養(yǎng)基后，可被細(xì)胞利用合成甘油三酯，磷脂和固醇類。mIRage檢測(cè)azide-PA的光譜結(jié)果顯示和PA相比，其在2100cm^-1具有疊氮基團(tuán)的吸收峰，因此azide-PA非常適合用于檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的脂質(zhì)分布。該團(tuán)隊(duì)通過(guò)此體系在前顆粒蛋白敲低的人類誘導(dǎo)多能干細(xì)胞及其分化的小膠質(zhì)細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了上調(diào)的脂質(zhì)代謝。

如上圖所示，該團(tuán)隊(duì)將hiPSC與神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞在含有azide-PA的培養(yǎng)基中培養(yǎng)24h后，使用mIRage進(jìn)行成像發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞在2096 cm^-1和1744 cm^-1的信號(hào)強(qiáng)度（圖A&圖B），及總脂質(zhì)/蛋白比（1740/1650）與新合成脂質(zhì)/總脂質(zhì)比（2096/1740）均高于hiPSC（圖C&圖D），表明在hiPSC分化過(guò)程中脂質(zhì)的合成更加活躍，脂質(zhì)的合成可能與早期腦發(fā)育有關(guān)。

綜上所述， mIRage可以在亞微米水平進(jìn)行高分辨率的單細(xì)胞化學(xué)成像分析，這項(xiàng)技術(shù)將帶來(lái)更多生物領(lǐng)域的新發(fā)現(xiàn)，助力開發(fā)更有效的疾病療法。

二、mIRage助力單細(xì)胞化學(xué)成像

瑞典隆德大學(xué)的Oxana Klementieva與Gunnar K. Gouras團(tuán)隊(duì)使用光熱紅外和X射線熒光直接對(duì)神經(jīng)元中的微量元素和相關(guān)分子結(jié)構(gòu)進(jìn)行化學(xué)成像，在這一研究中該團(tuán)隊(duì)使用mIRage對(duì)單神經(jīng)元細(xì)胞中β淀粉樣蛋白的分布和結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析，該成果在2021年以Correlative optical photothermal infrared and X-ray fluorescence for chemical imaging of trace elements and relevant molecular structures directly in neurons為題發(fā)表于Light: Science and Applications（影響因子20.6）上。

在這項(xiàng)研究中，該團(tuán)隊(duì)結(jié)合了兩種位于電磁波譜兩端的成像模式用于直接評(píng)估單個(gè)神經(jīng)元中的結(jié)構(gòu)和化學(xué)信息。結(jié)合基于新型光熱紅外 (O-PTIR)和同步加速器 X 射線熒光 (S-XRF) 納米成像技術(shù)的無(wú)標(biāo)記超分辨率微光譜進(jìn)行亞細(xì)胞成像并捕獲了同一神經(jīng)元中β淀粉樣蛋白的纖維形式。該研究發(fā)現(xiàn)在原代AD樣神經(jīng)元中，鐵簇與升高的淀粉樣蛋白β片層結(jié)構(gòu)和氧化脂質(zhì)共定位。

如上圖所示，該團(tuán)隊(duì)使用mIRage和S-XRF對(duì)單細(xì)胞整合成像，該團(tuán)隊(duì)首先使用mIRage可視化了β淀粉樣蛋白片層結(jié)構(gòu)和氧化脂質(zhì)的分布（圖a）；然后，使用S-XRF，可視化了相同神經(jīng)元中金屬離子的分布（圖b）。通過(guò)擬合mIRage和S-XRF圖像可以發(fā)現(xiàn)金屬鐵簇的位置與升高的β淀粉樣蛋白片層結(jié)構(gòu)和氧化脂質(zhì)高度相關(guān)（圖c和d）。

這項(xiàng)研究使用mIRage/S-XRF聯(lián)合單細(xì)胞成像證明了聚集鐵與升高的β淀粉樣蛋白片層結(jié)構(gòu)共定位的顯著相關(guān)性，表明用 Aβ(1–42) 治療可能導(dǎo)致Fe失衡，進(jìn)而可能導(dǎo)致脂質(zhì)氧化。該研究表明mIRage無(wú)需標(biāo)記即可直接對(duì)新鮮的生物樣本進(jìn)行檢測(cè)，分辨率達(dá)亞微米水平，代表了單細(xì)胞化學(xué)顯微成像技術(shù)的新突破。

三、mIRage助力開發(fā)新型納米無(wú)定形載藥顆粒

中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所的王璐璐團(tuán)隊(duì)開發(fā)了基于益生元的阿托伐他?。ˋT）納米無(wú)定形載藥顆粒（PANA），借助mIRage成功實(shí)現(xiàn)對(duì)該載藥顆粒的原位成分分析。該結(jié)果以Prebiotic-Based Nanoamorphous Atorvastatin Attenuates Nonalcoholic Fatty Liver Disease by Retrieving Gut and Liver Health為題發(fā)表于Small Structures （影響因子13.9）上。

在本研究中，該團(tuán)隊(duì)構(gòu)建了一種基于益生元的AT 納米無(wú)定形載藥顆粒(PANA)，通過(guò)恢復(fù)肝臟和腸道健康來(lái)提高 AT 對(duì)非酒精性脂肪性肝（NAFLD）的療效。非酒精性脂肪性肝病 (NAFLD) 的發(fā)病機(jī)制是多因素和復(fù)合性的，其中脂質(zhì)代謝紊亂引起的脂毒性是主要危險(xiǎn)因素之一。阿托伐他汀 (AT) 是廣泛使用的降脂藥物，然而，AT在腸道中的吸收率較低且該藥物會(huì)對(duì)腸道菌群造成破壞。與口服AT相變，構(gòu)建PANA載藥顆粒在肝臟組織中表現(xiàn)出更好的藥物積累。此外，PANA干預(yù)有效恢復(fù)了腸道健康，重建的腸道菌群，并改善了腸道免疫力、屏障完整性和炎癥。

如上圖所示，該研究團(tuán)隊(duì)使用mIRage對(duì)PANA的化學(xué)成分與空間分布進(jìn)行了鑒定。上圖為菊粉（益生元主要成分）、AT、PANA的紅外光譜。PANA中隨機(jī)選擇的樣品的紅外拉曼光譜如圖C（左）所示。AT中1,523 cm^-1處的羰基吸收在菊粉樣品中沒(méi)有信號(hào)為AT的特征峰（菊粉無(wú)此吸收峰）。按照 1,523?cm^-1（綠色）和 1,036?cm^-1（紅色）的映射，活性 AT 和益生元基質(zhì)的圖像在掃描區(qū)域（黃色）顯示出相同的分布，這意味著 AT 和菊粉在顆粒中均勻混合。此外，在 PANA 顆粒中可以觀察到 AT 在 1,580?cm^-1的苯吸收、1,457?cm^-1的強(qiáng) C-C 吸收和菊粉在 1,164?cm^-1 的 C-O 拉伸。這些分析清楚地證實(shí)了活性藥物在益生元基質(zhì)中的封裝和相對(duì)均勻的分布。

這項(xiàng)研究使用mIRage對(duì)載藥顆粒進(jìn)行了化學(xué)顯微成像，準(zhǔn)確表明不同化學(xué)成像在藥物顆粒內(nèi)的空間分布，為制藥工程探索藥物成分的空間分布提供了線索。

四、mIRage助力檢測(cè)環(huán)境微塑料

南京大學(xué)季榮教授與美國(guó)麻省大學(xué)邢寶山教授等合作，利用先進(jìn)的mIRage O-PTIR顯微光譜儀，建立了（微）塑料表面亞微米尺度化學(xué)變化表征方法，首先證實(shí)了蒸汽消毒引起硅橡膠老化具有普遍性，發(fā)現(xiàn)了一個(gè)曾被忽視但重要的人體及環(huán)境中微納塑料的來(lái)源。該工作以Steam disinfection releases micro(nano)plastics from silicone-rubber baby teats as examined by optical photothermal infrared microspectroscopy為題發(fā)表在Nature Nanotechnology（影響因子37.8）上。

該團(tuán)隊(duì)成功應(yīng)用mIRage化學(xué)成像顯微鏡揭示了硅橡膠奶嘴在蒸汽消毒過(guò)程中生成含有環(huán)狀/支化聚硅氧烷或聚酰亞胺微納塑料的過(guò)程及機(jī)制，發(fā)現(xiàn)了一個(gè)曾被忽視但重要的人體及環(huán)境中微納塑料的來(lái)源（見(jiàn)下圖）。

研究發(fā)現(xiàn)，硅橡膠嬰兒奶嘴的主要成分為聚二甲基硅氧烷（PDMS）及樹脂添加劑聚酰胺（PA）(圖b和c)，在經(jīng)過(guò)蒸汽消毒（100 °C）時(shí)表面發(fā)生降解并釋放出微納塑料顆粒(圖a)。借助mIRage化學(xué)成像技術(shù)，作者統(tǒng)計(jì)了奶嘴消毒過(guò)程中PDMS降解產(chǎn)生的1.5 μm以上塑料顆粒數(shù)量，并估算出正常奶瓶喂養(yǎng)一年進(jìn)入嬰兒體內(nèi)的該類微塑料總量約為66萬(wàn)顆，比此前文獻(xiàn)報(bào)道的兒童從空氣、水和食物中攝入的熱塑性微塑料數(shù)量之和高出一個(gè)數(shù)量級(jí)；假如這些微塑料全部被排入環(huán)境，全球平均排放量可能高達(dá)5.2萬(wàn)億個(gè)/年。

上述結(jié)果表明mIRage可以在無(wú)標(biāo)記條件下對(duì)微塑料進(jìn)行化學(xué)成像。

除了上述應(yīng)用外，mIRage這一熒光、紅外、拉曼三合一的化學(xué)成像顯微還在多個(gè)科研領(lǐng)域有所應(yīng)用：

1.  環(huán)境微塑料

微塑料顆粒（~600 nm）的O-PTIR光譜及成像分析

(引自Microscopy Today, 2022, 17, 3, 76-85)

2. 高分子材料

1210 cm^-1處采集的PP/PTFE的O-PTIR光譜和顯微圖像

(引自Materials & Design, 211 (2021), 17, 110157)

3. 半導(dǎo)體

薄膜晶體管顯示器中污染物的O-PTIR分析

器件表面缺陷的紅外和拉曼光譜同步（同時(shí)間、同位置）分析

(引自Microscopy Today, 2020, 28, 3, 26-36)

4. 生命科學(xué)

腦組織的明場(chǎng)顯微圖像、O-PTIR光譜及成像分析

5. 文物鑒定

柯羅19世紀(jì)繪畫作品中鋅皂異質(zhì)性的O-PTIR顯微光譜及成像分析

(引自Anal. Chem. 2022, 94, 7, 3103–3110)

mIRage國(guó)內(nèi)部分發(fā)表文章一覽

? 中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)借助mIRage成功實(shí)現(xiàn)對(duì)玉米粉中痕量微塑料的原位可視化表征。該工作發(fā)表在Science of the Total Environment上。

? 中科院過(guò)程工程研究所使用mIRage對(duì)利拉魯肽微球的藥物與載藥顆粒的化學(xué)成分與空間分布進(jìn)行了鑒定，該成果發(fā)表在ACS Applied Materials & Interfaces上。

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