新·冠疫情爆發(fā)以來(lái)，多種不同的疫苗(mRNA疫苗、慢病毒疫苗、滅活病毒等)在全·的抗疫中發(fā)揮了重大作用。然而現(xiàn)有的疫苗也有些局限性，如儲(chǔ)存運(yùn)輸條件苛刻、需要接種加強(qiáng)針、對(duì)突變病毒不敏感等等。近，bioRxiv發(fā)表了篇基于細(xì)菌外泌體的新型新·冠疫苗對(duì)疾病保護(hù)作用的文章，或許可以為新·冠疫苗的研發(fā)提供新的思路。

Jiang和Driedonks等^[1]通過(guò)對(duì)細(xì)菌來(lái)源的外囊泡表面修飾病毒S蛋白的受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域（RBD）制成了新型新·冠疫苗。革蘭氏陰性菌能夠產(chǎn)生外膜囊泡（OMV），在哺乳動(dòng)物體內(nèi)具有免疫刺激作用，可誘導(dǎo)免疫應(yīng)答發(fā)生并激活樹(shù)突細(xì)胞、T細(xì)胞、B細(xì)胞等免疫細(xì)胞，而經(jīng)過(guò)改造的工程菌產(chǎn)生的OMV內(nèi)毒性非常低，避免了不良反應(yīng)的發(fā)生。作者使用了種鼠傷寒沙門(mén)氏菌株，通過(guò)Spycatcher/Spytag體系使該菌株分泌的OMV通過(guò)共價(jià)鍵穩(wěn)定結(jié)合了病毒的RBD（圖1）。

圖1 （A）RBD重組抗原的設(shè)計(jì)，RBD連接到SpyTag的N端和C端；（B）RBD修飾的OMV示意圖。

研究人員在RBD-OMV制備完成后，使用全自動(dòng)外泌體熒光檢測(cè)分析系統(tǒng)Exoview檢測(cè)OMV表面是否成功結(jié)合了病毒RBD。其中，檢測(cè)芯片上包被了D001, D003, MM43三種病毒S蛋白以及LPS的抗體，分別用于捕獲RBD-OMV和所有OMV；捕獲完成后使用熒光抗體標(biāo)記對(duì)D001, D003, MM43進(jìn)行表型分析。后，使用Exoview的SP-IRIS無(wú)標(biāo)記成像技術(shù)檢測(cè)了OMV是否被成功捕獲，并通過(guò)熒光成像統(tǒng)計(jì)捕獲的不同表型OMV的數(shù)量。

圖2 RBD-OMV捕獲數(shù)量及表型檢測(cè)。A：SP-IRIS技術(shù)檢測(cè)不同抗體捕獲的OMV數(shù)量；B：熒光檢測(cè)不同表型OMV數(shù)量。

圖3 對(duì)照組捕獲數(shù)量及表型檢測(cè)。A：SP-IRIS技術(shù)檢測(cè)不同抗體捕獲的OMV數(shù)量；B：熒光檢測(cè)不同表型OMV數(shù)量。

圖4 RBD-OMV與對(duì)照組的捕獲的不同表型OMV數(shù)量對(duì)比。

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圖2A顯示S蛋白抗體和LPS抗體均捕獲到了數(shù)量相當(dāng)?shù)腛MV，表示OMV以很高的效率成功結(jié)合了新·冠病毒的RBD。圖2B的熒光標(biāo)記結(jié)果也證明了結(jié)合成功，但是結(jié)合D003的OMV數(shù)量相對(duì)較低。圖3A和圖3B的對(duì)照組結(jié)果表示僅有LPS抗體能夠捕獲到OMV，并且?guī)缀鯖](méi)有熒光標(biāo)記，表面對(duì)照組OMV上沒(méi)有結(jié)合RBD，將RBD-OMV與對(duì)照組的數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)對(duì)比（圖4），說(shuō)明RBD-OMV疫苗的異性非常好。

RBD-OMV疫苗制備完成后，研究人員使用倉(cāng)鼠模型對(duì)疫苗接種的效果進(jìn)行了檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)分為三組：接種疫苗的實(shí)驗(yàn)組（RBD-OMV），接種溶劑的溶劑對(duì)照組（mock）和接種未結(jié)合RBD的OMV的空白對(duì)照組（Ctrl-OMV）。研究人員對(duì)不同組別分別接種后，使用病毒感染倉(cāng)鼠，并進(jìn)行了系列測(cè)試以驗(yàn)證疫苗效果。

圖5 RBD-OMV與mock、Ctrl-OMV的體重。A&B：接種完成后，病毒感染前的體重記錄；C&D：病毒感染后的體重變化。

體重檢測(cè)結(jié)果顯示，在病毒感染前，三組倉(cāng)鼠的體重，無(wú)論雄性和雌性，隨時(shí)間均沒(méi)有顯著改變（圖5A&B）；病毒感染后，RBD-OMV組體重沒(méi)有下降，而mock與Ctrl-OMV組體重下降，在第三、四天達(dá)到顯著（圖5C&D）。

圖6 A：接種后Day42的抗S-RBD IgG滴度；B：抗S-RBD   IgG滴度隨時(shí)間的變化；C&D&E：Day48的BAL中抗S-RBD   IgG/IgM/IgA的滴度；F：病毒中和抗體測(cè)試的中和抗體滴度隨時(shí)間的變化；G：Day35 WT和Delta病毒株的中和抗體滴度比較。

血漿S-RBD IgG滴度測(cè)試結(jié)果顯示，接種后42天，RBD-OMV組的血漿S-RBD   IgG滴度更高，而兩個(gè)對(duì)照組的滴度位于檢測(cè)限度以下（圖6A）。為檢測(cè)呼吸道黏膜的抗體水平，研究人員檢測(cè)了肺泡灌洗液（BAL）的抗體滴度，RBD-OMV組中可檢測(cè)到IgG/IgM/IgA，兩個(gè)對(duì)照組則未檢測(cè)到。中和抗體測(cè)試表明，WT病毒株感染的抗體滴度與14天開(kāi)始上升，于28天達(dá)到峰值并可保持到35天（圖6F）；抗體的中和活性在Delta和WT中沒(méi)有顯著差異（圖6G）。

圖7A：肺部組織中的病毒滴度；B：BAL中的病毒滴度

TCID50檢測(cè)結(jié)果顯示，肺部組織（圖7A）和BAL（圖7B）中RBD-OMV組病毒滴度顯著低于兩個(gè)對(duì)照組，BAL組已達(dá)到檢測(cè)·低限度。

圖8 A：Day48不同組別倉(cāng)鼠的肺部形態(tài)；B&C：H&E染色結(jié)果及病變積分。

于48天處死倉(cāng)鼠并分離肺部，肉眼觀察可見(jiàn)RBD-OMV組的炎癥和出血病灶少于兩個(gè)對(duì)照組，具有更少的肺泡水腫（圖8A）；肺組織切片的H&E染色結(jié)果也顯示，RBD-OMV組的炎癥、出血病灶和肺泡萎陷更少，且雄性的病變積分更低（圖8B&C）。

以上所有檢測(cè)結(jié)果表明，這種RBD-OMV疫苗可誘導(dǎo)抗體分泌，分泌的抗體能夠中和野生型和Delta亞種病毒，證明了疫苗具有保護(hù)作用。OMV等外泌體疫苗具有如下勢(shì)：

• 產(chǎn)量高：細(xì)菌復(fù)制快，且能夠大量分泌OMV；

• 多功能：表面可修飾多種抗原；

• 組分構(gòu)成簡(jiǎn)單：疫苗不需要其他佐劑；

• 穩(wěn)定性高：在室溫下也能夠保持穩(wěn)定，可以凍干粉末的形式在低溫長(zhǎng)期保存。

以上結(jié)果說(shuō)明，基于OMV的外泌體疫苗具有廣泛的應(yīng)用前景，可作為阻斷新·冠肺炎以及其他傳染病傳播的有效手段。

在這項(xiàng)研究中，作者使用Exoview系統(tǒng)對(duì)結(jié)合了重組RBD的OMV進(jìn)行了表征分析，確定OMV上成功結(jié)合了新·冠病毒的RBD。Exoview在外泌體疫苗開(kāi)發(fā)中，可快速準(zhǔn)確地表征外泌體，并統(tǒng)計(jì)不同表型外泌體數(shù)量并計(jì)算其比例，適合作為多組分外泌體疫苗的標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)手段。

參考文獻(xiàn)：

[1]. Linglei Jiang, Tom Driedonks, Maggie Lowman,   Wouter S.P. Jong, ... & Kenneth W. Witwer. (2021). A bacterial   extracellular vesicle-based intranasal vaccine against SARS-CoV-2 protects   against disease and elicits neutralizing antibodies to wild-type virus and   Delta variant. bioRxiv. .

全自動(dòng)外泌體熒光檢測(cè)分析系統(tǒng)（ExoView R100）簡(jiǎn)介

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