本文轉(zhuǎn)載自 北大生科院儀器中心

多功能單細(xì)胞顯微操作系統(tǒng)FluidFM BOT，是將原子力系統(tǒng)、微流控系統(tǒng)、細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)合為體的單細(xì)胞操作系統(tǒng)，采用不同孔徑的微型納米注射器，可實(shí)現(xiàn)單細(xì)胞注射（Injection）、活細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)提?。‥xtraction）、單細(xì)胞分離（Isolation）、粘附力測(cè)定（Adhesion）、納米打印(Nano-printing)等多種功能，更多功能及應(yīng)用請(qǐng)參考如下文章。

點(diǎn)擊了解更多詳情：多功能單細(xì)胞顯微操作系統(tǒng)FluidFM BOT的原理與應(yīng)用介紹

本次講座與培訓(xùn)將介紹FluidFM技術(shù)的原理及應(yīng)用，著重講解在活細(xì)胞單細(xì)胞組學(xué)域的進(jìn)展，Live-Seq技術(shù)可直接在活細(xì)胞無(wú)損提取細(xì)胞內(nèi)容物進(jìn)行測(cè)序工作，能夠提供更加原生和真實(shí)的測(cè)序信息，讓單細(xì)胞的基因表達(dá)動(dòng)力學(xué)研究成為可能。

報(bào)告信息：

應(yīng)用講座：

5月25日

北京大學(xué)金光樓311上午09:30—10:30

上機(jī)培訓(xùn)（掃碼報(bào)名，名額有限）：

5月25日

北京大學(xué)金光樓126下午13:00—17:30

報(bào)告人:  胡西 博士

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報(bào)告人簡(jiǎn)介：

胡西，Application Scientist of Quantum Design China，加州大學(xué)洛杉磯分校博士后。主要負(fù)責(zé)單細(xì)胞顯微操作設(shè)備的技術(shù)支持和市場(chǎng)推廣活動(dòng)，并具有豐富的流體力顯微鏡（FluidFM）的操作經(jīng)驗(yàn)。

主辦單位：鳳凰工程北大基地光學(xué)成像平臺(tái)

協(xié)辦單位：Quantum Design 中國(guó)

科研進(jìn)展文章導(dǎo)讀：

單細(xì)胞測(cè)序在疾病診斷和細(xì)胞異質(zhì)性研究中發(fā)揮著重要作用。然而目前的單細(xì)胞測(cè)序手段需要將細(xì)胞消化并裂解才能夠進(jìn)行，而細(xì)胞狀態(tài)在這操作中不可避免的會(huì)發(fā)生改變，因此很難掌握細(xì)胞真實(shí)的基因表達(dá)情況， 尤其對(duì)于基因通路上表達(dá)變化的檢測(cè)為不。近期蘇黎世聯(lián)邦理工學(xué)院使用FluidFM創(chuàng)建了種原位活細(xì)胞基因測(cè)序方法，這種方法能夠在不殺死細(xì)胞的情況下完成對(duì)細(xì)胞的測(cè)序工作。通過(guò)這種技術(shù)該團(tuán)隊(duì)成功完成單細(xì)胞RNA基因測(cè)序，并通過(guò)這種方法檢測(cè)到了細(xì)胞的基因表達(dá)和細(xì)胞周期狀態(tài)變化。下面本文就這項(xiàng)工作的具體內(nèi)容進(jìn)行闡述。

1. Live-Seq測(cè)序技術(shù)簡(jiǎn)述

由于單個(gè)細(xì)胞的RNA總量?jī)H有10 pg。為了實(shí)現(xiàn)無(wú)損的單細(xì)胞測(cè)序，該團(tuán)隊(duì)使用FluidFM對(duì)現(xiàn)有的scRNA-Seq單細(xì)胞測(cè)序的方法進(jìn)行了化。為了盡可能的接近Smart-Seq的測(cè)試條件，該團(tuán)隊(duì)采用了將緩沖液吸入探針，然后再進(jìn)行細(xì)胞提取的操作。這樣可以確保所提取的RNA能夠與緩沖液混合，從而避免RNA的降解。通過(guò)這方法，該團(tuán)隊(duì)成功實(shí)現(xiàn)了IBA細(xì)胞的測(cè)序，證明了這種方法的可行性（圖1）。

圖1. Live-Seq技術(shù)a. Live-Seq技術(shù)的示意圖和代表圖片，黑色箭頭指代液面；b. IBA細(xì)胞測(cè)序的質(zhì)量控制圖（n=10）。

2. Live-Seq技術(shù)分析細(xì)胞系和細(xì)胞狀態(tài)

為了證實(shí)Live-Seq的有效性，該團(tuán)隊(duì)對(duì)多種細(xì)胞系進(jìn)行了測(cè)序，這其中包括IBA細(xì)胞、小鼠脂肪干細(xì)胞和祖細(xì)胞（ASPCs）以及脂多糖處理的RAW264.7細(xì)胞和Mock處理的RAW264.7細(xì)胞。通過(guò)對(duì)這些細(xì)胞系進(jìn)行測(cè)序發(fā)現(xiàn)，該方法能夠區(qū)分上述細(xì)胞系，并且在征基因檢測(cè)中能夠找到每種細(xì)胞所對(duì)應(yīng)的征基因，證明了Live-Seq方法的有效性（圖2）。

圖2. Live-Seq單細(xì)胞測(cè)序區(qū)分細(xì)胞型及細(xì)胞狀態(tài)a. 實(shí)驗(yàn)方法示意圖，使用LPS和PBS對(duì)RAW細(xì)胞進(jìn)行處理；b. 前500個(gè)高度易變基因的tSNE圖；c. 前面10個(gè)的細(xì)胞型、細(xì)胞狀態(tài)差別基因的熱圖；d. 小鼠基因圖譜預(yù)測(cè)，使用前面100個(gè)標(biāo)記基因的團(tuán)簇；e. Live-Seq對(duì)比scRNA-Seq的錨點(diǎn)分析，顯示兩者沒(méi)有顯著差異。

3. Live-Seq技術(shù)對(duì)細(xì)胞的活力基本沒(méi)有影響

Live-Seq技術(shù)的勢(shì)在于提取過(guò)程中不會(huì)破壞細(xì)胞。通過(guò)對(duì)提取前后的測(cè)序?qū)Ρ瓤梢园l(fā)現(xiàn)，提取組與空白組之間的團(tuán)簇沒(méi)有顯著性差異。并且通過(guò)對(duì)細(xì)胞形態(tài)的觀察中，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞的形態(tài)基本沒(méi)有改變，并且多數(shù)細(xì)胞仍然能夠正常分裂（圖3）。

圖3. Live-Seq對(duì)細(xì)胞活力的影響a. 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的示意圖；b. Live-Seq測(cè)序后不同時(shí)間點(diǎn)（1h,4h）的scRNA-Seq的tSNE圖；c.不同時(shí)間點(diǎn)scRNA-Seq所有能夠發(fā)現(xiàn)差異的基因（共12個(gè)）；d.不同時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞形態(tài)圖片。

4. Live-Seq技術(shù)能夠記錄細(xì)胞下游分子表型事件

由于Live-Seq對(duì)細(xì)胞生理狀態(tài)影響小，因此能夠監(jiān)測(cè)在細(xì)胞代謝過(guò)程中的基因變化。通過(guò)對(duì)比LPS處理的巨噬細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，Live-seq技術(shù)與對(duì)照組的細(xì)胞代謝水平相比沒(méi)有明顯變化，因此這種方法測(cè)量的數(shù)據(jù)十分接近細(xì)胞代謝中基因表達(dá)的真實(shí)水平。通過(guò)測(cè)序?qū)Ρ萀PS處理與空白的測(cè)序結(jié)果發(fā)現(xiàn)Nfkbia與Tnf的表達(dá)為相關(guān)。這結(jié)果也驗(yàn)證這種測(cè)序方法在檢測(cè)細(xì)胞下游表型時(shí)的勢(shì)。

圖4. Live-Seq技術(shù)的單細(xì)胞縱向分析a. 實(shí)驗(yàn)示意圖；b. 不同處理細(xì)胞的mCherry強(qiáng)度變化；c. 3~7.5h之間mCherry強(qiáng)度變化；d. Tnf-mCherry強(qiáng)度變化的線(xiàn)性回歸模型；e. Nfkbia與Tnf在Live-Seq測(cè)序中的表達(dá)關(guān)系；f. Nfkbia與Tnf在scRNA-Seq測(cè)序中的表達(dá)關(guān)系；g. Live-Seq測(cè)序中細(xì)胞處于S期的評(píng)分；h. Live-Seq測(cè)序中細(xì)胞周期的mTnf-mCherry強(qiáng)度變化；i.Tnf-mCherry的熒光強(qiáng)度增量（3~7.5h）。

5. Live-Seq技術(shù)對(duì)同細(xì)胞多次測(cè)序

Live-Seq技術(shù)的無(wú)損性甚至能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)單個(gè)細(xì)胞的多次測(cè)序。通過(guò)對(duì)單個(gè)細(xì)胞兩次提取后細(xì)胞活力變化的觀察中發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞的活力即使在2次提取后仍沒(méi)有發(fā)生明顯的變化，基因型分析也沒(méi)有發(fā)現(xiàn)明顯的基因表型改變。

圖5. Live-Seq對(duì)細(xì)胞的多次提取j.連續(xù)測(cè)序的示意圖和代表圖像；k.Live-Seq的tSNE圖；l.整合Live-Seq和scRNA-Seq的tSNE圖。

6. 總結(jié)

Live-Seq是種十分具有前景的單細(xì)胞測(cè)序的新方法，得益于FluidFM技術(shù)的無(wú)損提取的勢(shì)，Live-Seq技術(shù)除了能夠?qū)崿F(xiàn)傳統(tǒng)測(cè)序的功能外，還降低了細(xì)胞的損傷，能夠提供更加原生和真實(shí)的測(cè)序信息。這種點(diǎn)甚至讓單細(xì)胞的基因表達(dá)動(dòng)力學(xué)研究成為可能。相信隨著這種技術(shù)自動(dòng)化的提高，將為單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)帶來(lái)更多可能。

參考文獻(xiàn)：

[1]. Genome-wide molecular recording using Live-seq, Wanze Chen, Orane Guillaume-Gentil, Riccardo Dainese, Pernille Yde Rainer, Magda Zachara, Christoph G. Gäbelein, Julia A. Vorholt, Bart Deplancke, bioRxiv 2021.03.24.436752；doi: https://doi.org/10.1101/2021.03.24.436752

相關(guān)產(chǎn)品

1、多功能單細(xì)胞顯微操作系統(tǒng)- FluidFM BOT